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游离RNA(cell-free RNA,cfRNA)是指存在于体液中细胞外的内源性或外源性RNA,包括mRNA、lncRNA和miRNA等。其中血浆游离mRNA、lncRNA由于携带丰富的信息,逐渐成为液体活检的重要组成部分。想要高效又高质量的提取出血浆游离RNA,我们要搞清楚血液来源样本的类型有哪些,血浆游离RNA提取方法如何选择,试剂盒的选择标准是怎样的?

一、什么是外周血,什么是全血,什么是血清,什么是血浆?

新鲜的血液(也叫全血,医学上称为外周血)加入抗凝剂(如柠檬酸钠,EDTA等,一般医院采血都是用抗凝管采集),静置一段时间,会出现分层的现象。上面淡黄色的半透明液体是血浆,约占55%,下面暗红色不透明的是红细胞,约占45%。中间薄薄的一层白色物质是白细胞和血小板,不到1%。红细胞、白细胞、血小板共同组成了血细胞。

特别提示:不加抗凝剂的血液很快就会凝成血块,在凝血块周围出现的淡黄色的透明液体是血清,血清中不含纤维蛋白原。

简单来说,全血包括血浆和血细胞(红细胞、白细胞、血小板),血浆包括血清和纤维蛋白原。

二、血浆游离RNA含量过少,选择何种方法提取?

常用的血浆游离RNA提取方法主要有酚-氯仿法、硅胶磁珠吸附法(磁珠法)以及硅胶膜吸附柱法(柱式法),其中酚-氯仿法由于其毒性大、提取效率低、重复差等特点并不适宜用于血浆游离RNA提取。目前主要用于血浆游离RNA提取的方法以磁珠法和柱式法为主。由于提取原理上的缺陷,磁珠法的提取富集度和灵敏度远不如离心柱法,而即使是离心柱法,目前也存在富集倍数偏低的问题。但要获得大量高浓度的游离RNA,柱式法是目前weiyi的选择。一些生物公司如Qiagen、Takara、Biog等都研发出了比较不错的血浆游离RNA提取产品。

三、血浆游离RNA试剂盒的选择标准?

1) 较高的提取得率

在实验试剂的选择中,如果选择不谨慎,很有可能导致提取的RNA浓度过低将无法进一步分析,如基因克隆、基因检测、微生物核酸检测、测序、分子杂交等,所以选择正确的试剂非常关键,可以直接提高实验的成功率。Qiagen、Takara、Biog等公司都具有较为先进的技术,可使血浆游离RNA获得较高的提取得率。其中,国内Biog所研发的血清血浆游离RNA提取试剂盒(中提)可高效富集提取液体样本中的低丰度游离RNA,较普通试剂盒的提取浓度大幅提升3倍以上,有效克服了一般试剂盒样本量大、洗脱液多、RNA 提取终浓度依然较低的缺点,可广泛用于Northern杂交、RT-PCR、Real Time RT-PCR、cDNA 文库构建、测序等各种常规分子生物学实验。

2) 提取的RNA纯度高

  核酸纯度一般根据A260/A280比值来判断。A260/A280是指DNA或RNA在260nm处的吸光值与在260nm处的吸光值的比值,用来表示DNA或RNA的纯度的。纯RNA的A260/A280=2.0。当样品被蛋白质或者酚污染的话,A260/A280值会下降。RNA样品被DNA污染的话,A260/A280值会下降。

使用国外Q公司血浆RNA提取试剂盒提取的血浆RNA,A260/A280一般在1.8-1.9之间;使用BIOG血清血浆游离RNA提取试剂盒(中提)提取的血浆RNA,A260/A280一般在1.8-2.0之间,使用T公司血浆RNA提取试剂盒提取的血浆RNA,A260/A280比值在1.7-1.9之间。Q公司提取RNA的纯度似乎优于国产试剂,但我们提取的RNA是用于PCR检测,结果并无明显影响。可能因为Biog公司血清血浆游离RNA提取试剂盒(中提)提取的血浆RNA得率较高的原因,同样的RNA加样体积(2uL),Biog试剂盒提取的RNA荧光定量PCR检测结果CT值要优于Q公司试剂盒提取的RNA。

3) 操作简便性

  就我们曾经用过的以上三种提取试剂盒来说,Q公司的血浆RNA提取试剂盒提取过程大约35min,从样本处理开始需要个13步骤;T公司血清/血浆游离RNA提取试剂盒整个提取过程需要约50min,从样本开始处理11个步骤;Biog公司的血清血浆游离RNA提取试剂盒(中提)提取过程大约25min,从样本开始处理10个步骤。可见Biog公司的血浆游离RNA提取试剂盒(中提)在操作简便性上具有一定优势,更适合于较多样本的检测。

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