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新一代核酸染料—CelRed 和CelGreen,EB完美替代品!

Goyoo公司研发推出的EB替代染料,染色效果和EB差不多,在紫外下不容易淬灭,可以用于胶回收。但价格较贵。

CelRed和 CelGreen 是两种集高灵敏、低毒性和超稳定性于一身的极佳的荧光核酸凝胶染色试剂。其水溶染色剂通过美国环保局安全认定,废弃物可直接倒入下水道,而不会造成任何环境污染。其特点有:

1)高灵敏度:CelRed和 CelGreen是目前市场中最灵敏的凝胶核酸染料之一;

2)稳定性极好:可以使用微波炉加热,可以在室温下保存;

3)更安全:艾姆斯氏试验结果表明,该染料的诱变性远小于溴化乙锭(EB);

4)广泛的适应性:适用于预制凝胶和凝胶电泳后染色;

5)染色过程简单:与EB一样,在预制胶和电泳过程中不必担心染料降解;而电泳后染色过程也只需30分钟且无需脱色或冲洗;

6)对 DNA 和 RNA 的迁移影响小:对核酸迁移的影响小于 SYBR Green I;

7)与标准凝胶成像系统以及可见光激发的凝胶观察装置完美兼容:使用 312nm 激发的 UV 凝胶成像系统时,CelRed可以完美的替代EB;使用 254nm 激发的 UV 凝胶成像系统或可见光激发的凝胶观察装置时,CelGreen足以替代任意一种 SYB染料。但该染料会使小片段DNA迁移慢一些(与EB相比).

Gold View I型/II型

Goldview对于大片段DNA的染色效果良好,但是在对于500bp以下的片段效 果不是很好,还有一个很致命的弱点是它的荧光基团在紫外灯下非常容易淬灭,一般5-10min条带就会消失。另外Goldview不适用于胶回收。 Goldview其实就是AO(丫啶橙,一种剧毒产品)且荧光效果远不如EB,灵敏度差,本底色严重,不利用于回收,不稳定,在紫外灯下其诱导突变能力极 高

SYBR Green 和SYBR Gold

稳定性差,也有毒性。它属于花箐素类核酸染料,花箐类染料不是无毒的,而只是低毒的, 电泳级别的是经过修饰的,修饰有三种:1.加入卤素或*基。2.插入环羟基。3.加入稳定剂。SYBR Green I是高灵敏的DNA荧光染料,适用于各种电泳分析,操作简单:无须脱色或冲洗。至少可检出20pg DNA,高于EB染色法25-100倍。SYBRGreen I 与dsDNA 结合荧光信号会增强800-1000倍,用SYBR Green I染色的凝胶样品荧光信号强,背景信号低。SYBR Green和SYBR Gold相对于EB的稳定性要差很多。SYBR系列的染料也能进入细胞染色线粒体以及核内的DNA,从而产生危害。SYBR Green I已被证实在紫外光下将会产生强诱变能力,使DNA或其他物质发生突变。



几种核酸染料的比较

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新一代核酸染料—CelRed 和CelGreen

要想获得安全的凝胶染料必须能清除或最小化染料和基因组DNA的相互作用。基于这种原则,科学家们结合物质的结构特点,开发出了一款不会渗透乳胶手套*类手套和生物细胞膜的一种染料。

CelRedCelGreen是为代替高毒性的EB设计产生的新一代荧光核酸染料。由Biotium公司开发。相对于EB和其他的EB替代物,CelRedCelGreen有更多的优势:低毒性,高灵敏性,高稳定性。

EB由于其价格低和足够高的灵敏性,使其成为近几十年来最常用的核酸凝胶染料。但是 EB是一种强诱变化学试剂。由于其存在的安全危害以及处理污染物所花费的大量金钱,使其使用变得并不廉价,也不再方便。基于这种原因,替代品开始出现,比如SYBR系列染料近年来开始应用于市场中。但这些产品虽然降低了危害性,却损失了产品的灵敏性和稳定性。比如SYBR Safe的灵敏性很低,SYBR Green和SYBR Gold相对于EB的稳定性要差很多。SYBR系列的染料也能进入细胞染色线粒体以及核内的DNA,从而产生危害。SYBR Green I已被证实在紫外光下将会产生强诱变能力,使DNA或其他物质发生突变(Ohta,et al.Mut Res 492,91(2001))。

SYBR Safe则不能做到。此外,环境安全实验也显示CelRedCelGreen对水栖动物没有影响,因此CelRedCelGreen没有环境破坏性,使用后能做一般的处置。

CelRedCelGreen特点:

更安全:艾姆斯氏实验以及其他实验证实无诱变性无细胞毒性;

更方便处理:通过了环境安全实验,可以直接丢弃无需特殊处理。

超灵敏:比EB和SYBR Safe更灵敏。

更稳定:室温下,溶液中可稳定存在。

使用更方便:可预染也可后染。

与常用的仪器兼容:CelRed可用EB常用仪器观察;CelGreen可用SYBR染料仪器进行观察。

可用于下游实验:普通的胶回收后,可用于下游实验。




 EB                                                            CelRed

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 SYBR Safe                                           CelGreen

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图1. CelRedCelGreen比EB和SYBR Safe更灵敏。左图:比较了CelRed和EB 的1%预制胶,TBE缓冲液跑胶。右图:比较了CelGreen和SYBR Safe 1%琼脂糖凝胶的后染状况,同样在TBE缓冲液中完成。选用了Invitrogen的1 Kb的DNA Ladder作2倍稀释,分别加入四个泳道中,从左向右依次为200ng,100ng,50ng和25ng。


  SYBRSafe                       CelRed                        CelGreen

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图2. CelRedCelGreen更安全,因为它们不能穿过活细胞的细胞膜结合到DNA上。用1×SYBR Safe,CelRedCelGreen分别在37℃孵育Hela细胞。随后用FITC处理过的SYBR Safe和CelGreenCelRed及Cy3处理CelRed孵育细胞。SYBR Safe很快进入细胞使核染色。CelRedCelGreen不能穿过细胞膜,不能观察到被染上色的细胞,仅在少量死亡的细胞中看到零星的荧光。


Super ECL Plus超敏发光液 [ Super ECL Plus Detection Reagent ]

1. 产品描述:

SuperECL Plus超敏发光液用于检测直接或间接标记辣根过氧化物酶HRP的抗体及其关联的抗原。由于采用了独特的发光底物系统,SuperECL Plus超敏发光液是目前最灵敏的商业化荧光ECL检测试剂:

(1)具有极高灵敏度和高信噪比,可检测10~100 fg抗原;

(2)可在日光灯下进行发光操作;

(3)发光迅速,荧光可使X光胶片感光达12小时以上,特别适用于痕量蛋白或核酸检测;

(4) 可使用更高的抗体稀释倍数(1:2000~1:10000),极其节省抗体。

2. 用途:用于HRP标记抗体的Western BlotHRP标记探针的核酸杂交。

3. 使用方法:

(1)执行常规SDS-PAGE、转膜和Western Blot步骤。注意用HRP标记lgG或用一抗-链亲和素-生物素-HRP夹法。

(2)Western Blot最后一次洗膜的同时新鲜配制发光工作液:分别取等体积的溶液A和B,放入干净容器中混合。建议立即使用工作液,室温放置数小时后仍可使用但灵敏度略有降低。

(3)用镊子取出膜,搭在滤纸上沥干洗液但勿使膜完全干燥。将膜完全浸入发光工作液(0.125mL发光工作液/cm2膜)中,与发光工作液充分接触。室温孵育3分钟,准备立即压片曝光。孵育时间过长不会增加灵敏度,有时还会导致曝光条带异常。发光过程的本质是酶促反应,使用过少的发光工作液不利反应进行,也会导致膜上条带曝光不均和明显降低灵敏度。为达节约目的可将膜剪小但勿降低发光液用量。

(4)用镊子夹起膜,搭在滤纸上沥干发光工作液。但勿洗去发光液。

(5)打开X光胶片暗盒,在暗盒内表面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将Western Blot膜贴在保鲜膜上,将保鲜膜折起来完全包裹Western Blot膜,去除气泡和皱褶,可剪去边缘部多余的保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖Western Blot膜的保鲜膜固定在暗盒内,蛋白带面向上。

(6)暗房内压X光胶片,分别曝光不同的时间如数秒到数分钟。显影冲洗。           

4. 储存:4℃密封避光保存一年以上。短期可放置室温。

5. 安全性:无特殊毒性,按普通化学品处理。

6. 注意事项:

(1)步骤1~5可在日光灯下操作;但发光液曝露于强光下时间过久灵敏度可能略有降低,移到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。

(2)长时间曝光或蛋白过量,将加深背景并使条带强弱变化失去线性关系。曝光不足则条带模糊。

(3)发光工作液孵育约3分钟后膜上的条带发光。强条带发光在暗房中肉眼可见,低丰度蛋白条带发光较弱甚至肉眼不可见但可使X光胶片曝光。不能简单以肉眼观察判断条带发光时间。肉眼不可见的荧光实际上可持续数小时并使X光胶片感光,因而弱带可曝光1-10小时。如果曝光后条带不佳,可用洗膜缓冲液洗膜,重新孵育二抗,然后重新用ECL发光和曝光。

(4)由于超敏发光液极其灵敏,强烈推荐大多数进口抗体起始浓度为一抗1:1000~1:4000,二抗1:2000~1:5000。抗体浓度过高将造成高背景或没有条带,导致失败。对于大量蛋白需要将SuperECL 稀释20-25倍使用。

(5)某些保鲜膜包裹印迹膜时可能会淬灭荧光,应选择高质量保鲜膜。

(6)使用肉眼可见的预染色蛋白Marker和荧光-放射自显影曝光标签可精确确定胶片上条带的位置和大小。

(7)NaN3能抑制HRP活性,回收第二抗体应避免使用NaN3,如必需使用勿超过0.01%。



WB试剂盒——Western Blot实验整套解决方案

Western Blot实验检测几乎就是一个“事倍功半”的过程:繁琐的步骤、大量时间精力以及相对较高的实验失败率所带来最好的回报也仅仅只是CV>35%的半定量结果。

  做WB实验时,你是否遇到这些烦恼?

  费时:所需试剂均需单独购买,试剂查找、对比耗费大量时间;

  费力:所需试剂均需单独配制、调整配比、验证可用性;

  费钱:很多试剂一次用不完,造成浪费;

  操作复杂:每一步流程均需反复摸索合适的实验条件;

  效率低下:优化实验条件时,人为差异性大,极易造成结果不准确。

  WB实验怎样才能更快更好的做完呢?

  ——你需要整套的Western Blot解决方案

  Elabscience结合用户需求,特推出Western Blot试剂盒,试剂盒内为经典Western Blot实验所需全套试剂,为您顺利做出理想的Western Blot实验结果提供了便捷。

  WB试剂盒的优势:

  更省时:包含了从蛋白提取到ECL底物曝光在内的所有试剂,一次性购买到位;

  更省力:各种试剂均已配好,不需要单独调整配比;

  更简便:试剂盒内含有详细流程及试验条件,无需反复摸索;

  更高效:检测灵敏度高,经过多次验证证明,实验结果客观、准确;

  更省钱:一个试剂盒可供完成5块凝胶(约50个样)对应的Western Blot实验,无浪费;

  更贴心:试剂盒内附有每种试剂的详细说明,包含试剂配方、用法、保存温度及注意事项等;

  更多元:根据待检测蛋白分子量大小,可灵活选择不同规格的WB试剂盒。

  Elabscience Western Blot 试剂盒组成


  赠送试剂:

  
  实例展示:

  抗体:HSP70 Polyclonal Antibody (E-AB-40208)

  使用Western Blot试剂盒 (E-IR-R304A) 中的试剂,并按照试验指南操作过程,WB结果如图: